近日，一項迄今為止最大的iPSC基因組學研究發表于Nature Genetics上，并因一篇某公眾號標題為“iPSC應用再次蒙上陰影，劍橋大學證實近四分之三的iPSC細胞系DNA受到嚴重損傷”的文章而引起了國內一些受眾的不安和關注，擔心會對iPSC臨床轉化造成負面影響。安全警示固然重要，但正確的科普和求真負責的態度也很重要。讓我們先來了解一些細胞和基因突變的常識，然后也一起看看在該研究原文中，英國劍橋大學和桑格研究所的研究人員到底講的是什么。
基本常識
首先，先來普及一些細胞和基因突變的基本常識：
1. 人體內的細胞在正常細胞分裂的每次DNA復制中，包括受日常UV照射、氧化損傷等均有一定機率出現染色體DNA突變，也叫體突變（somatic mutation），一般以單堿基差異（突變）Single Nuclei Variation（SNV）為主。之所以原本叫差異（variation）而不叫突變（mutation）是因為在大量人基因組測序中，發現不同人種、族群甚至個體的許多基因有很多基因序列的差異，包括很多單堿基差異，但基本不影響基因功能，或者不影響個體生理或健康，由于無法定義哪個版本是標準的序列，也就無法定義哪些是突變。
2. 實際上人體組織或者人本身就是一個雜合體（Mosaicism），因為人體的不同細胞擁有所積累的不同的基因組DNA體突變。體突變是相對于胚系突變（germline mutation）而言的。在全基因組測序中，個別細胞的體突變在所測的上千細胞中的比例（頻率）可以類似0.1%、30%等不同，但胚系突變一般為50%（單條染色體）或100%（兩條染色體）。
3. 就如同我們初中和高中的生物課的遺傳學基礎里所學，即使是胚系遺傳突變，也有許多突變由于在非編碼區、或屬于編碼一致的同義突變、或位于基因的一些不影響最終所翻譯蛋白功能的區域，不影響性狀，或者是僅在沉默的染色臂上不會被轉錄（隱形、顯性）。體突變也是如此，并且由于體突變只在一些細胞中存在，而不像胚系突變在所有細胞中都攜帶，即使屬于功能突變，也主要影響攜帶突變的少量細胞，而不一定會導致組織或個體的異常。
4. 是否體外培養細胞和傳代會導致更多的細胞DNA體突變？是的，只要有細胞分裂或細胞會受到氧化損傷、UV照射等，就會產生體突變。
5. 是否只要細胞有DNA突變就代表會致病或造成癌癥？不一定，細胞和機體有一系列的糾錯機制和保護設置幫助對抗這些隨機錯誤。1）許多突變不一定影響了腫瘤相關基因（細胞周期相關基因等）的表達和功能；2）即使是腫瘤相關基因的DNA功能突變，無論是DNA復制或非分裂細胞的DNA氧化損傷造成，首先有DNA聚合酶、堿基錯配修復等多重機制對DNA（包括線粒體DNA）損傷進行修復，當突變不可修復或太大量會啟動細胞的自殺程序促使細胞凋亡；其次當這些機制失靈時，如果有突變是導致某些重要基因的某處染色體上的拷貝無法表達，通常重要的基因會有其他冗余備份的拷貝可以彌補表達；再次在一些突變導致的蛋白出現錯誤時影響其折疊或結構，也有高爾基體等“質控部門”幫助檢查出錯誤蛋白并送去溶酶體等部門進行降解（報廢品處理）；再再次即使有錯誤的蛋白到達崗位，也有許多腫瘤抑制的信號通路對這些錯誤信號進行控制和糾正；最后如果所有這些機制都沒有能達到效果，當細胞出現異常不受控的分裂時，機體會有免疫系統“糾察隊”監視和啟動撲滅這些細胞的程序。只有當所有以上程序和機制全部都失敗，才會有惡性腫瘤或癌癥出現的風險。
6. 衰老是癌癥的最正相關的影響因素，也是由于衰老后細胞的抗氧化及DNA糾錯修復等機制，以及機體的免疫機能等在衰退，所以當有細胞出現或積累腫瘤相關突變后，更容易形成腫瘤。
7. 優勢突變一般是指一些DNA突變由于導致細胞具有分裂或存活的更大優勢，或者說有選擇優勢，而在一個細胞群體中的頻率逐步升高，最后變成該群體的共有突變。
文章解析
讓我們回到這篇Nature Genetics的研究文章，從其他引用文獻及研究人員利用深度全基因組測試技術檢測健康人皮膚或血液EPC來源的不同iPSC系的發現可知：
1. 即使是來自于胚胎發育最早階段的ESC（胚胎干細胞），也有多篇文獻報道發現由于體外培養壓力攜帶TP53這樣的突變和染色體異常；但也有文獻報道臨床級ESC的突變率很低且沒有腫瘤相關突變。
2. iPSC所攜帶的體突變主要（95%以上）來源于重編程所來源的體細胞。
3. 皮膚或血液EPC來源的不同iPSC系在染色體異常（結構性異常）層面沒有差異，但72%的皮膚來源iPSC的體突變主要為UV照射相關突變，而血液EPC來源的iPSC的體突變主要是來源于氧化損傷（ROS）。
4. 皮膚來源不同iPSC單克隆的體突變頻率差異較大，可以相差10倍，有的克隆完全沒有UV相關的體突變，可能與所取皮膚組織被重編程的具體單個成纖維細胞的部位有關。因此，全面的基因組分析和單克隆的篩選非常重要，這也是為什么同一次重編程獲得的iPSC單克隆細胞株之間差異非常大的原因。
5. 皮膚來源的iPSC克隆性較高（也即來自于單個細胞克隆，后續繼續傳代，子代之間突變差異較?。?，而皮膚成纖維細胞的異質性較高（多克隆性）。
6. 正常人體組織中的細胞也有一些腫瘤相關基因突變，但不表現異?；蛭窗l展為腫瘤。
7. BCOR突變是唯一找到的與選擇壓力相關的突變，可能導致血液腫瘤AML等疾病，出現的頻率在血液EPC來源的iPSC中要明顯高于皮膚來源的iPSC（約四分之一攜帶）。進一步研究發現，BCOR突變主要是在成血細胞（erythroblast）的體外培養（重編程前）和重編程后的細胞培養中受選擇壓力影響而不斷產生的。
8. BCOR突變在皮膚來源的iPSC中比較少見，且沒有在成纖維細胞中發現，提示該突變的壓力選擇可能和不同細胞的培養條件有關。
9. 帶有BCOR突變的iPSC向神經分化的能力受到影響，更傾向于中胚層分化。
10. iPSC與源頭體細胞差異的獲得性突變主要由培養中的氧化損傷造成，且與傳代次數正相關，這與其他非iPSC細胞株，包括ESC等是一致的。
文章解析
早在2016年，另一項發表在Plos Genetics雜志上的研究（同樣來自英國劍橋大學和桑格研究所）就對iPSC中的基因突變譜系歷史進行了追蹤，主要結論摘錄如下：
1. 體細胞（血液EPC）每個細胞每次傳代平均增加14個SNV突變，而iPSC大約為0.8-1.2個，H9 ESC大約為1.7個，僅為體細胞突變每代增加突變數量的十分之一。也即，iPSC和ESC傳10代所積累的突變約等于體細胞傳代一代的突變數量。推測這與iPSC和ESC的多能狀態（分裂的DNA復制方式、高DNA糾錯水平）等有關。
2. 沒有在所分析的任何一個iPSC系的DNA突變中發現有選擇優勢的突變。
最后我們來了解一下霍德是如何建立一株臨床級iPSC細胞株的（僅克隆篩選和基因組穩定性安全性策略相關部分）：
1. 首先，經過供者篩查的健康捐贈者無論皮膚或血液細胞經過必須的擴增培養后進行一定的質量控制和凍存，一部分細胞用于重編程；
2. 重編程得到一般500以上單細胞或多細胞克隆，挑選合適的多個克隆進行一定擴增后再次挑選單克??；
3. 獲得30-100個單克隆后擴增凍存，選擇部分克隆分批進行WGS及WES測序，通過已建立的分析方法與多個數據庫比對后沒有腫瘤致病突變或其他和分化產品相關突變的iPSC細胞株，才算達到初步的質控標準，才會進行下一步的質控，優選的細胞株將進行分化/生產測試，最終優選的細胞株將用于建立細胞庫。
4. 建立細胞庫后，不同級細胞庫以及分化的終產品還會再進行WGS及WES測序，包括細胞庫進行傳代穩定性研究，沒有異常致病突變，這樣的細胞庫才能用于臨床級細胞產品的生產。細胞產品進行凍存后，只有達到所有的放行質量標準，通過體內外的各種安全性、成瘤性、致瘤性研究（免疫缺陷動物評估長達1年以上）后才能申報用于臨床。
所以，相對于沒有辦法做到足夠把控的原代體細胞產品，或基因編輯、慢病毒感染隨機插入基因組等類型的工程化細胞產品（因產品的細胞異質性和穩定性時間有限，無法凍存等限制），iPSC或ESC來源的細胞產品無論從產品批次的一致性、穩定性還是基因組的安全可控性上來說其實是更高的。
綜上所述，對于iPSC衍生細胞治療產品開發的企業和研發人員來說，重視和采取相應的單克隆篩選措施和質量控制等對iPSC及其產品的基因組穩定性和安全性進行監控和把控是常規需要做到的。當然，另一方面也提示了即使是iPSC非臨床應用的研究者們也應注重iPSC的克隆篩選和全基因組測序分析，尤其是一些遺傳性疾病的細胞模型或基因編輯后用于疾病機制研究的細胞株，如果沒有進行全面的基因組分析，一些來源細胞的體突變可能會影響iPSC向某些譜系細胞的分化和表型，從而得出錯誤的結論。
自2014年以來，ESC和iPSC衍生的不同種類細胞的臨床轉化在全球范圍內都有陸續展開，目前經過嚴格的質量和安全性把控，正規的注冊制審批或備案進入臨床的品類并未有在人體內成瘤的報道。這也從側面說明克隆的選擇、工藝的成熟度、完善的質控和足夠長時間的安全性、成瘤性評價對于這一類型產品臨床安全的重要性和必要性。
霍德生物針對iPSC及細胞產品開發了：1）全基因組測序檢測細胞遺傳穩定性及安全性的分析方法；2）終產品中多能干細胞殘留的數字PCR檢測方法（目前可達百萬分之四的檢測靈敏度）；3）終產品scRNAseq單細胞轉錄組測序檢測細胞組成的分析方法等平臺檢驗分析方法和對應的企業標準。除體外克隆形成實驗、《中國藥典》法的裸鼠成瘤實驗外，免疫全缺陷小鼠的長期成瘤致瘤實驗符合FDA申報要求的1年以上觀察，均是為了最大程度地保證終產品的質量和安全性。
縱觀整個細胞治療領域，iPSC衍生細胞產品因有望解決細胞來源和批量化生產、穩定性、一致性、安全可控、成本可及等一系列的成藥性的挑戰，并且在已進行的多項臨床試驗中展現出良好的長期安全性和針對多種包括難治性疾病的有效性，正在逐步走向商業化。希望更多像這樣有價值的研究能被正確、公正地傳達給普通受眾，讓大家理解這一領域的發展和優勢，并帶著審慎而樂觀的態度助力這些細胞藥物更早惠及目標患者人群。
